癌症是一个全球性的重大健康问题，造成巨大的痛苦和生命损失. 不同类型的癌症, 胰腺癌很突出, 它的五年存活率只有11%.5%(胰腺癌). 尽管竭尽全力, 胰腺癌的侵袭性阻碍了治疗方法的发展, 肿瘤细胞的迅速扩散, 以及缺乏可靠的诊断工具. 预后不良与早期缺乏特异性症状有关, 因此, progression to a later stage before proper diagnosis. In the rare instances when pancreatic 癌症 is detected early, it occurs during regular checkups or screening for unrelated issues. Much research into the biology of pancreatic 癌症 is in progress. 其中一个奇怪的发现是原发性纤毛细胞器的显著丧失与晚期胰腺癌的进展有关(Quilichini等). 2019)
在细胞生物学领域, 我们遇到初级纤毛, 都是单数, antenna-like immobile organelles found in most cell types. Primary cilia play a pivotal role in various cellular functions, 由于它们独特的接收和响应各种外部细胞信号的能力. 这种功能的一个例子发生在胚胎发育过程中Hedgehog (Hh)信号传导的背景下. Hh信号通路控制发育过程中组织和器官的生长和模式. 当被称为Hh蛋白的特殊信号分子附着在细胞膜上的受体上时, they trigger a cascade of molecular events within the cilium. 结果是, 在胚胎发生过程中，控制细胞命运和组织模式的信号系统被激活. 初级纤毛传递这些信号的能力对于肢体的形成至关重要, 神经管发育, 以及胚胎发育的其他方面, emphasizing their importance in orchestrating complex biological processes.
最近的研究表明，原发性纤毛与每一种癌症特征之间存在联系, Kiseleva, 和 Golemis 2018; Fabbri 和 Mazure 2019). 这种联系有助于科学家清楚地界定纤毛在癌症中的作用. 例如, research has identified that inhibition of ciliogenesis, 或者是纤毛的组装和拆卸, 对于激活Hedgehog信号和乳腺癌向更具侵袭性的发展至关重要, 转移性疾病(Hassounah等). 2017). 曼彻斯特澳门葡京网赌游戏克里斯汀·约翰逊(Kristen 约翰逊)实验室的研究重点是一种名为FOXN2的蛋白质如何影响纤毛的发生，并可能影响胰腺癌的发展到更严重的阶段. 我的个人项目, 由哈默尔本科生研究中心的暑期本科生研究奖学金(SURF)资助, 探索FOXN2如何影响纤毛数量和结构，以及刺猬信号在一种经常被研究的哺乳动物细胞系中的作用.
What kind of protein is FOXN2 和 why do we care about it?
The process of ciliogenesis is intricately intertwined with the cell cycle. 细胞周期的一个基本方面是中心粒复制的调控, small structures within the cell directing its division, 和 the accurate segregation of chromosomes during cell duplication. 中心粒在纤毛组装中也起着至关重要的作用. 在细胞周期的G0期, 发生在细胞分裂之外的阶段, 母中心粒在分化成基体并迁移到细胞质膜的过程中起着关键作用, 从哪里开始纤毛聚集. 值得注意的是, 控制中心粒复制的蛋白质具有抑制新纤毛组装开始的能力. 细胞周期与纤毛发生的相互调节与中心粒有关. 考虑到纤毛在发育和生理中具有多重作用，以及纤毛发生和细胞周期过程和机制的复杂性, 纤毛缺陷会诱发多种疾病，这是唯一合理的说法. Cilia defects have already been linked to several human disorders, including but not limited to polycystic kidney disease, 视网膜变性, 和癌症(Duldulao), Li, 和太阳, 2010).
正常纤毛功能所需的基因可受转录因子的影响, which are proteins able to control which genes are “on” or “off.FOXN2蛋白是叉头转录因子家族的一员. 这些转录因子在器官发育过程中介导基因表达发挥重要作用, 细胞代谢, 和免疫调节, 和, 值得注意的是, in tumor formation 和 metastasis when their regulation falters (Bach et al., 2018; Golson 和 Kaestner,2 016). FOXN2的失调与几种癌症有关(FOXN2在肾癌中的表达), 马等人. 2018, Nagel等人.2018); however, FOXN2影响肿瘤形成的具体分子途径仍需进一步研究. Recent computational analyses conducted by the 约翰逊 laboratory, 使用RNA-Seq, 发现了FOXN2和纤毛相关基因之间有趣的新联系. 根据这些数据, 我们假设FOXN2将作为纤毛发生和可能的Hedgehog信号传导的负调节因子. 这意味着我们预测了 FoxN2 gene in cells will result in fewer 和 shorter cilia. 这反过来会对Hedgehog信号传导产生负面影响，并导致机体内的失调, 可能促进癌症进展. (注:为澄清起见， FOXN2是一种蛋白质 FoxN2 是一个编码蛋白质的基因吗. 当我们谈论表达时, 我们谈论的是基因, 当我们讨论信号或调节器时, 我们讨论的是蛋白质.)
本研究的结果将用于进一步加深我们对纤毛发生的认识，并建立FOXN2表达与纤毛脱落现象之间的明确联系, 以及FOXN2与Hedgehog信号通路的可能关联. 当鼠标 成纤维细胞作为模型, 这些发现将来可以应用于人类胰腺癌细胞, 这可能会导致未来癌症治疗替代疗法的发展.
方法及初步结果
One of our research objectives included introducing FoxN2 小鼠成纤维细胞系NIH3T3，并建立FOXN2与纤毛发生之间的联系. This cell line is a prevalent model system for studying primary cilia. NIH3T3细胞在培养中易于维持，在分子和细胞生物学研究中具有重要的应用价值. 另外, 最近的研究证实，NIH3T3是研究Hedgehog信号通路时最适合使用的两个细胞系之一(Gómez等). 2022).
在细胞中，l低血药浓度, 或者血清饥饿, 导致细胞周期阻滞, 是什么导致了初级纤毛的形成. 因此, NIH3T3细胞形成初级纤毛, 我们通过在低血清浓度的培养基中培养细胞来诱导细胞周期阻滞. 根据之前的研究, 我们预计纤毛NIH3T3细胞在饥饿后48小时左右达到峰值. 这确实被证明了，我们66%的细胞在48小时后长出了初级纤毛.
Based upon our hypothesis of FOXN2 being a negative regulator of ciliogenesis, it was expected that overexpression (increased presence) of FoxN2 会导致纤毛数量减少吗, 中心粒, 和 cilia length in cells that express primary cilia, 如NIH3T3细胞. Lipofectamine transfection technique was used to overexpress FoxN2. This technique uses a lipid complex to encapsulate genetic material such as FoxN2 和 pass through protective layers, delivering it into the cell. 为了使结果可视化, 我用免疫荧光染色技术对纤毛进行染色，并在荧光显微镜下观察纤毛的变化. 通过免疫荧光染色获得的初步数据为FOXN2在纤毛发生中的调节作用提供了令人信服的见解. NIH3T3细胞过表达 FoxN2 showed a discernible decline in the number of cilia present. 这一证据证实了工作假设, indicating that FOXN2 serves as a negative regulator of ciliogenesis.
转染FLAG-empty(对照组)的NIH3T3细胞株原代纤毛免疫荧光检测, FLAG-FOXN2, FLAG-FOXN2 Ubiquitnation mutant plasmids following 48-hour serum starvation. 纤毛用Arl13b(小鼠)初级抗体和AF 647(抗小鼠)次级抗体染色. af647是假的青色. Cells transfected with FLAG-FOXN2 shows ciliation compared to FLAG empty, FLAG-FOXN2 Ubiq未检测到纤毛.
As part of our aim, I also explored a ubiquitin-deficient mutant of FoxN2. FOXN2的降解先前已经在肺癌的背景下进行了研究, 并且发现FOXN2在调节蛋白泛素的帮助下被分解, 哪些标记蛋白质被降解. To further investigate this finding, scientists generated a FoxN2 ubiquitin-deficient mutant that made the FOXN2 protein more stable (马等人. 2018). 尽管这种突变体尚未在纤毛发生和胰腺癌的背景下进行研究, 我们预计这种突变体FOXN2在细胞中的存在会增加对纤毛发生的负面影响. 创造一个变种的 FoxN2, 我用分子克隆技术生成了质粒(DNA的小圆形片段)，其中包含了DNA的变化，编码了一个版本的 FoxN2 这是不能降低的. 我在NIH3T3细胞中进行了类似的过表达实验. 我们观察到，含有这种突变体的细胞与含有正常形式FOXN2的细胞相比，纤毛数量明显减少. This provides further substantiation that when FOXN2 is stable, it exerts a more pronounced inhibitory influence on ciliogenesis. 这进一步支持了我们澳门葡京网赌游戏FOXN2负调控纤毛发生的假设, 通过这样做, its presence could possibly speed up the progression of pancreatic 癌症. 从理论上讲, 用于癌症治疗, we could develop something that increases ciliogenesis, 例如通过降低FOXN2的水平.
另一个研究目标是建立FOXN2和Hedgehog信号传导之间的联系. To do this, we added a Smoothened Agonist to FOXN2 expressing NIH3T3 cells. When Smoothened Agonist binds to the Smoothened protein, 它可以开启Hedgehog信号, 模仿纤毛发出的自然信号. 值得注意的是，到目前为止，评估具有激活的Hedgehog通路的细胞反应的实验尚未产生结论性的结果. Further investigations are warranted to elucidate this aspect comprehensively.
下一步是什么??
尽管我们的完整发现即将到来, 进一步研究FOXN2与纤毛发生之间的新联系是有必要的. 展望未来, 约翰逊实验室计划复制免疫荧光染色实验并研究蛋白质表达, 蛋白质相互作用, 和 activation of 信号通路 using Western blotting experiments. Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), 定量测定细胞中某些基因数量的一种分子生物学技术, will be used to determine cells’ response to Hh pathway stimulation.
另外, experiments with different FOXN2 mutants will be studied. 虽然ubiquitin-deficient FoxN2 mutant results in stabilized expression of FoxN2一个DNA结合域 FoxN2 变种人的假设正好相反. The mutation in the DNA binding domain prevents the FOXN2 binding of DNA, 这是它作为转录因子的必要条件. With lack of functioning FOXN2, we might expect to see normal ciliogenesis. 虽然ubiquitin-deficient FoxN2 mutant serves only as a tool to support our hypothesis, DNA binding domain FoxN2 mutant additionally has implications to be developed into a treatment. 概念上，这是正常的 FoxN2 被DNA结合域取代了吗 FoxN2 胰腺细胞突变, it will induce normal ciliogenesis 和 slow the progression of the disease, 哪些可以帮助开发胰腺癌治疗的替代疗法.
提出我自己的研究项目的经历, attaining results to find an answer to an unanswered question, 把它展示给更大的科学界，巩固了我把研究作为职业的愿望. 不断发展的研究本质是一个充满无限机会的智力奖励之旅, 推动人类知识的边界听起来是一项有益的努力. I have recently interviewed for biomedical sciences Ph.D. 我正在考虑几份工作邀请. 研究提供动态, 跨学科, 和 innovative opportunities for those passionate about knowledge. 我想成为塑造未来的一份子, 对我们对世界的理解，尤其是对生物学的理解产生了持久的影响.
我要感谢我的导师. 克里斯汀·约翰逊，感谢她在我的大学生涯中始终如一的指导和支持. 她的耐心、鼓励和洞察力在这个研究项目中是无价的. 我也要感谢Dr. 约翰逊的实验室成员，我很高兴与他们分享这一奇妙的经历. Thank you to the Hamel Center for 本科研究 staff 和 Mr. Dana Hamel通过暑期本科生研究奖学金(SURF)为他们提供经济支持.
参考文献
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作者和导师简介
Nadine埃米尔”, 从曼彻斯特, 新汉普郡, 是工场澳门葡京网赌游戏计划和部落国家生物荣誉协会的成员. 她于2023年12月毕业于曼彻斯特的澳门葡京网赌游戏，获得生物技术学士学位. 她的研究得到了哈默尔大学本科生研究中心提供的暑期本科生研究奖学金，并在秋季学期继续这个项目, 展示她的成果 as a part of her senior capstone project. 纳丁加入了. 约翰逊的实验室，因为她钦佩她的教学和指导，并想从她那里学到更多. 胰腺癌的研究课题, 哪个以好斗著称, 这激起了纳丁的兴趣. 她也很好奇，想要制定自己的研究计划，并追求自己感兴趣的假设. Nadine learned a lot to further underst和 what experiments to conduct, 他们的目的, 以及如何排除故障. 她探索了分子机制等主题, 信号通路, 以及它们在人类疾病中的作用, 她希望将来能更多地研究它们. 虽然研究有时很困难, Nadine found the troubleshooting process to be fun 和 enjoyed the challenge. 她把她的研究报告提交给 调查 作为一种挑战自己的方式，有效地向普通观众展示结果. 她想在整个职业生涯中继续从事研究，并计划进入一所大学 Ph.D. 秋季课程. 她很高兴获得了进行独立研究的宝贵经验, 展示她的成果, 发表她的发现.
Dr. 克里斯汀C. 约翰逊 是曼彻斯特澳门葡京网赌游戏生命科学系的副教授, 自2017年以来，她一直在哪里教书. 她的研究方向是癌症生物学, 和 she teaches cell 和 molecular biology 和 biotechnology. Dr. 约翰逊是一名研究癌症的研究生，他一直对这一领域的研究充满热情. 她目前的研究项目是与哥伦比亚大学的一位朋友合作的结果. 她已经指导了50多名本科生研究人员，纳丁是她的第一个 调查 作者. Dr. 约翰逊 describes this project as having its successes 和 failures, 和其他的一样, yet Nadine was able to roll with the ups 和 downs 和 adapt accordingly. Dr. 约翰逊很幸运能与许多优秀的本科生一起工作，他为每个人都认真对待自己的角色并在实验室里努力工作而感到自豪. 纳丁是一位非常有才华的年轻女性，她对研究充满热情. 约翰逊. “我为纳丁的下一个冒险感到兴奋，因为她将在秋天开始研究生院的学习!”
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